Một số đặc tính sinh học của chủng virus vaccine nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 sau bảo quản

Bệnh dịch tả vịt là một bệnh phổ biến trên toàn thế giới do Anatidalphaherpesvirus 1 (AnHV-1)thuộc họ Herpesviridae gây bệnh cấp tính với tỷ lệ chết cao ở đàn vịt. Bệnh gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi vịt của Việt Nam.Trong nghiên cứu này, chủng virus vaccine nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 được bảo quản sau 5 năm ở -86⁰C đã được khảo sát về một số đặc tính sinh học. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng virus có khả năng nuôi cấy và phát triển ổn định trên trứng gà có phôi 9 – 11 ngày tuổi với các chỉ số ELD₅₀ và EID₅₀ tương ứng là 10^-4,2 và 10^-5,1/0,2 ml. Hỗn dịch virus có tính an toàn và hiệu lực cao với vịt thí nghiệm, tỷ lệ bảo hộ đạt từ 96-100%.

Từ khóa: Dịch tả vịt, đặc tính sinh học, DP-EG-2000, ELD₅₀, EID₅₀

Some Biological of A Duck Enteritis Virus (DEV) Attenuated Vaccine Strain of DP-EG-2000 after maintaining

Summary

Duck plague (duck viral enteritis) is a worldwide disease caused by Anatid alphaherpesvirus 1 (AnHV-1) of the family Herpesviridae that causes acute disease with high mortality rates in flocks of ducks, causing serious economic lossesin commercial duck production in Vietnam. In this study, the Duck enteritis virus attenuated vaccine strain of DP-EG-2000 preservedafter 5 years at -86⁰C wasexamined forsome biological characteristics. The study results showed thatthe present attenuated DEVDP-EG-2000vaccine strain is capable ofculturingandstable developmenton embryonated eggs of 9–11 daysold with indicatorsELD₅₀ andEID₅₀of 10^-4,2 và 10^-5,1/0,2 ml, respectively. The virus strain has a high safety and efficiency for experimental ducks, the protection rate is from 96% to 100%.

Key words: Duck viral enteritis, DP-EG-2000, ELD₅₀, EID₅₀, after maintaining.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Virus gây bệnh dịch tả vịt thuộc họ Herpesviridae,  giống Mardivirus, loài Anatid alphaherpesvirus 1. Dịch tả vịt là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, gây tỉ lệ tử vong cao ở các loài vịt, ngan, ngỗng, gây thiệt hại kinh tế đáng kể đối với ngành chăn nuôi thủy cầm ở Việt Nam và thế giới (OIE, 2010).Virus gây bệnh dịch tả vịt thuộc họ Herpesviridae,  giống Mardivirus, loài Anatid alphaherpesvirus 1. Dịch tả vịt lần đầu tiên xuất hiện ở Hà Lan năm 1923, và sau đó lan rộng ra khắp châu Âu, châu Á và châu Mỹ (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013). Riêng ở Việt Nam, dịch tả vịt xuất hiện đầu tiên vào khoảng những năm 1960 và gây thiệt hại đối với ngành chăn nuôi gia cầm lên tới 20% mỗi năm (Morrissy và cộng sự, 2004). Bệnh có tỉ lệ chết cao, lên tới 90% ở các đàn vịt không được tiêm phòng. Bên cạnh đó, việc kiểm soát sự lây lan của bệnh gặp rất nhiều khó khăn do virus có thể tồn tại lâu trong môi trường hoặc truyền lây qua các kí chủ tự nhiên (Wolf và Burke, 1982).

Ngoài ra, sự phát triển của ngành chăn nuôi vịt đã làm xuất hiện các biến chủng mới, làm giảm hiệu quả bảo hộ của các loại vaccine hiện có (Li và cs, 2009). Đặc biệt, Nguyễn Đức Hiền (2012) đã chỉ ra sự khác nhau về hiệu quả bảo hộ của các loại vaccine hiện có đối với các chủng virus DEV lưu hành trên vịt và ngan ở Việt Nam. Theo Quyết định số 63/2005/QĐ – BNN và Quyết định số 64/2005/QĐ – BNN được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 13/10/2005, thì bệnh dịch tả vịt được coi là bệnh nguy hiểm của động vật, phải áp dụng các biện pháp phòng bệnh bắt buộc. Bệnh dịch tả vịt là một trong 7 bệnh phải tiêm phòng bắt buộc và yêu cầu tỷ lệ tiêm phòng phải đạt 100%.

Hiện tại, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đang thực hiện nhiệm vụ lưu giữ và bảo tồn nguồn gen cây trồng và nguồn gen vi sinh vật thú y, trong đó có chủng virus vaccine dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 đã bắt đầu được đưa vào bảo tồn từ năm 2015, đây là chủng đạt tiêu chuẩn  để nghiên cứu và sản xuất vacxine phòng bệnh dịch tả vịt. Việc lưu giữ và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật sẽ tạo được nguồn vật liệu cho công tác giảng dạy, nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng đào tạo tại Học viện. Để đánh giá được hiệu quả của nhiệm vụ lưu giữ và bảo tồn nguồn gen này, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá lại một số đặc tính sinh học của chủng virus nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 sau 5 năm bảo quản. Kết quả của nghiên cứu này sẽ là cơ sở cho nhóm nghiên cứu được tiếp tục thực hiện nhiệm vụ lưu giữ và bảo quản an toàn nguồn gendo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn giao.

2. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu

Xác định khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 trên phôi gà.

Xác định chỉ số ELD₅₀, EID₅₀ của chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000.

Xác định tính an toàn và hiệu lực của chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 sau bảo quản trên vịt thí nghiệm.

2.2. Nguyên liệu

 – Chủng virus vaccine nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 được bảo quản sau 5 năm dưới dạng nước trứng tươi ở -86⁰C.

– Chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04 dùng để kiểm tra hiệu lực của hỗn dịch virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000.

– Phôi gà ấp từ 9-11 ngày tuổi, sinh ra từ những đàn gà bố mẹ khỏe mạnh.

– Vịt con 25-35 ngày tuổi khỏe mạnh, không có kháng thể dịch tả vịt.

– Trang thiết bị, dụng cụ và vật tư hóa chất khác.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp xác định khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 trên phôi gà

Khả năng thích ứng và ổn định khi truyền đời qua phôi gà của chủng virus nhược độc DP-EG-2000 sau bảo quản được đánh giá bằng phương pháp tiêm truyền trên trứng gà có phôi 9 ngày tuổi. Mỗi lần cấy truyền dùng 30 phôi gà thí nghiệm để tiêm virus dịch tả vịt nhược độc chủng DP-EG-2000 và 5 phôi đối chứng không tiêm. Chủng virus DP-EG-2000 được pha thành huyễn dịch 10^-2 trong dung dịch nước muối sinh lý 0,9% và được tiêm vào xoang niệu mô của trứng gà (0,2ml/phôi). Theo dõi thí nghiệm trong 4-6 ngày rồi đánh giá kết quả.

2.3.2. Phương pháp xác định chỉ số ELD₅₀ (liều gây chết 50% phôi) và chỉ số EID₅₀ (liều gây nhiễm 50% phôi) của chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000.

Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, mỗi lần pha giống virus với nước sinh lý thành 8 độ pha loãng từ 10^-1 đến 10^-8. Mỗi độ pha loãng tiêm cho 5 phôi, mỗi phôi tiêm 0,2 ml. Sau khi tiêm, theo dõi phôi ở các thời điểm từ 24 giờ đến 96 giờ. Xác định tổng số phôi chết và tổng số phôi sống ở từng độ pha loãng. Các chỉ số liều virus gây chết 50% phôi trứng (ELD₅₀) và liều virus gây nhiễm 50% phôi trứng (EID₅₀) được xác định theo phương pháp của Reed và Muench (1938).

2.3.3. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn của hỗn dịch kháng nguyên

Sử dụng vịt ở các lứa tuổi, khoẻ mạnh, không nằm trong ổ dịch, chưa tiêm pḥòng vacxin dịch tả vịt. Tiến hành tiêm hỗn dịch kháng nguyên cho vịt phòng thí nghiệm với liều tiêm gấp 10 lần liều sử dụng, vịt ngoài thực địa tiêm với liều sử dụng (10³EID₅₀). Sau khi tiêm, theo dõi đàn vịt 10 ngày. Hỗn dịch kháng nguyên được coi là an toàn khi sử dụng cho cơ thể chưa mắc bệnh phải đạt các yêu cầu sau: Con vật không có phản ứng phụ, không sốt hoặc chỉ sốt nhẹ, ăn uống và hoạt động bình thường, không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và sức sản xuất.

2.3.4. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của hỗn dịch kháng nguyên

Sử dụng phương pháp công cường độc để kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin. Dùng vịt 15 ngày tuổi khoẻ mạnh, chưa tiêm phòng vacxin dịch tả vịt. Chia vịt thành 2 lô:

– Lô thí nghiệm: tiêm hỗn dịch kháng nguyên virus dịch tả vịt nhược độc  DP-EG-2000 với liều 10³EID₅₀.

– Lô đối chứng: không tiêm hỗn dịch kháng nguyên

Sau 21 ngày, dùng giống virus dịch tả vịt cường độc chủng VG-04 tiêm cho vịt với liều 10² LD₅₀, tiêm dưới da. Theo dõi vịt trong thời gian 14 ngày. Hiệu lực của vacxin được đánh giá thông qua tỷ lệ bảo hộ của đàn vịt.

Tỷ lệ bảo hộ (%)= x 100

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả xác định khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 trên phôi gà sau bảo quản

Thí nghiệm được tiến hành 3 lần, mỗi lần sử dụng 30 phôi thí nghiệm và 5 phôi đối chứng. Trong đó mỗi phôi thí nghiệm được tiêm 0,2ml huyễn dịch virus có nồng độ 10^-2 của chủng gốc virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000. Phôi đối chứng không được tiêm virus.Kết quả được thể hiện ở bảng 1 cho thấy: Chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 vẫn có tính thích ứng cao và ổn định trên phôi gà 9 ngày tuổi. Tính thích ứng đó biểu hiện ở sự nhân lên của virus trong phôi, gây chết phôi ở từng thời điểm tương đối ổn định và số phôi chết tập trung ở khoảng thời gian từ 49-72 giờ. Phù hợp với tài liệu của OIE (2012), chủng virus dịch tả vịt thích nghi trên phôi gà khi nuôi cấy trên phôi, thời gian gây chết phôi tập trung từ 48 đến 96 giờ sau khi tiêm.

Bảng 1.Kết quả cấy truyền chủng gốc virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 trên phôi gà

(Mẫu giống gốc bảo quản 5 năm ở -86⁰C)

Ghi chú: (-): Phôi gà đối chứng sống và phát triển bình thường

Kết quả theo dõi biến đổi bệnh lý của phôi sau khi gây nhiễm virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 được trình bày ở bảng 2.Bệnh tích xuất huyết trên da là phổ biến nhất (100%), sau đó là gan sưng, tụ máu, xuất huyết (73,8%). Phù phôi thấy rõ ở ở các phôi chết trong khoảng từ 49-96 giờ. Đặc biệt phôi còi cọc thấy ở các phôi chết trong khoảng thời gian từ 73-96 giờ. Bệnh tích phôi được thể hiện ở hình 1.Như vậy, kết quả cấy truyền cho thấy chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 qua quá trình bảo quản vẫn giữ được tính ổn định về độc lực và khả năng thích nghi cao trên phôi gà.

Bảng 2.Kết quả kiểm tra bệnh tích đại thể trên phôi sau khi gây nhiễm virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000

Hình 1. Phôi gà xuất huyết, còi cọc

3.2. Kết quả xác định chỉ số ELD₅₀ của chủng virus vaccine nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 sau bảo quản

Trong nghiên cứu này kết quả kiểm tra chủng virus vaccine DP-EG-2000 cho thấy chỉ số ELD₅₀ qua các lần chuẩn độ là ổn định, giao động từ 10^-4,0/0,2 ml  đến 10^-4,4/0,2 ml. ELD₅₀ trung bình của chủng virus vaccine DP-EG-2000 đạt 10^-4,2/0,2 ml (Bảng3).

Bảng 3. Kết quả xác định chỉ số ELD₅₀ của chủng virus vaccine nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 sau bảo quản

Theo Lê Văn Lãnh (1991), chủng virus dịch tả vịt nhược độc chủng Jansen khi nuôi cấy trên phôi gà có chỉ số ELD₅₀ biến động trong khoảng từ10^-4,2/0,2 ml đến 10^-4,5/0,2 ml.Theo Nguyễn Bá Hiên (2005), virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 khi nuôi cấy trên phôi gà có chỉ số ELD₅₀ biến động trong khoảng từ 10^-4,22/0,2ml đến 10^-4,25/0,2ml. Theo OIE (2012), virus dịch tả vịt nhược độc thích nghi trên phôi gà phải có tối thiểu 10³ELD₅₀ cho một liều sử dụng. Cũng theo Nguyễn Bá Hiên và cs (2016), chỉ số ELD₅₀ trung bình của chủng virus này khi kiểm tra là 10^-4,3/0,2ml. Như vậy, kết quả xác định chỉ số ELD­₅₀ của chủng virusdịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 cho thấy sau thời gian 5 năm bảo quản, giống virus vẫn giữ được mức độ ổn định về chỉ số ELD_­50 trên phôi gà.

3.3. Kết quả xác định chỉ số EID₅₀ của chủng virus vaccine nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 sau bảo quản

Chỉ số EID₅₀ qua các lần chuẩn độ là ổn định, biến động từ 10^-5,0/0,2 ml đến 10^-5,4/0,2 ml. EID₅₀ trung bình của chủng virus vaccine DP-EG-2000 10^-5,1/0,2 ml (Bảng 4).

Bảng 4. Kết quả xác định chỉ số EID₅₀ của chủng virus vaccine nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000

Theo Nguyễn Bá Hiên và cs (2016), virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 khi nuôi cấy trên phôi gà có chỉ số EID₅₀ biến động trong khoảng từ 10^-5,2/0,2ml đến 10^-5,4/0,2ml. Việc xác định được chỉ số EID₅₀ của chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 là vô cùng quan trọng giúp cho việc nghiên cứu xác định được liều gây nhiễm virus thích hợp trên trứng trong nghiên cứu sản xuất vaccine. Trong thực tế sản xuất vaccine, người ta thường dùng nồng độ 100 – 1000 lần liều EID₅₀để chắc chắn phôi trứng gà bị nhiễm virus.Như vậy, kết quả xác định chỉ số ELD₅₀ và EID₅₀ cho thấy chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 sau 5 năm bảo quản dưới dạng nước trứng tươi ở -86⁰C vẫn giữ được tính  thích ứng và phát triển ổn định trên phôi gà.

3.4. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của hỗn dịch kháng nguyên

Để kiểm tra chỉ tiêu an toàn của hỗn dịch kháng nguyên dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000chúng tôi tiến hành thí nghiệm đối với vịt 35 ngày tuổi, thí nghiệm được tiến hành trên 3 lô.Hỗn dịch kháng nguyên khi sử dụng được tiêm với liều 10³ EID₅₀/con vào dưới da. Sau khi tiêm, theo dõi phản ứng cục bộ nơi tiêm trong 24 giờ và phản ứng toàn thân trong 14 ngày. Kết quả trình bày ở bảng 5.

Bảng 5.Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của hỗn dịch kháng nguyên dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000

Qua bảng 5 cho thấy các đàn vịt sau khi tiêm hỗn dịch kháng nguyên dịch tả vịt nhược độc chủng DP-EG-2000 đều khoẻ mạnh, ăn uống và hoạt động bình thường, tỷ lệ an toàn đạt 100%.

3.5. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của hỗn dịch kháng nguyên

Hiệu quả phòng bệnh của hỗn dịch kháng nguyên phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó hiệu lực của hỗn dịch kháng nguyên được đánh giá là yếu tố quyết định. Vì vậy, kiểm tra hiệu lực của hỗn dịch kháng nguyên là khâu không thể thiếu trong kiểm nghiệm bất kỳ mộtloại vacxin nào. Để kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của hỗn dịch kháng nguyên virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000,chúng tôi sử dụng phương pháp công cường độc. Thí nghiệm được tiến hànhvới 3 lô hỗn dịch kháng nguyên. Kết quả thể hiện ở bảng 6.

Qua bảng 6 cho thấy đối với những vịt con nuôi thí nghiệm được tiêm hỗn dịch kháng nguyên, ở cả 3 lần thí nghiệm I, II và III, sau 14 ngày công cường độc bằng chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04, tỷ lệ bảo hộ đạt 96-100%. Trong khi đó, tất cả vịt đối chứng ở các lần thí nghiệm sau khi công cường độc qua thời gian theo dõi 14-20 ngày đều chết với triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả vịt (Hình 2, 3, 4, 5). Điều này chứng tỏ hỗn dịch kháng nguyên dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 chế trên phôi gà cho hiệu lực cao khi sử dụng.

Bảng 6. Kết quả xác định chỉ tiêu hiệu lực của vacxin dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000

TN: Thí nghiệm                      ĐC: Đối chứng

Hình 2. Vịt liệt chân

Hình 3. Xuất huyết dạ dày tuyến và dạ dày cơ

Hình 4. Thực quản xuất huyết

Hình 5. Ruột xuất huyết hình vòng nhẫn

Theo OIE (2000), vacxin nhược độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi gà để sử dụng phòng bệnh cho đàn vịt phải đạt được các chỉ tiêu vô trùng, an toàn và hiệu lực. Vacxin được coi là an toàn sau khi dùng cho vịt con mẫn cảm một liều vacxin gấp 10 lần liều sử dụng, vị trí tiêm dưới da hoặc tiêm bắp, theo dõi 7-14 ngày vịt vẫn ăn uống, hoạt động bình thường. Vacxin đạt chỉ tiêu hiệu lực khi vịt con mẫn cảm được tiêm vacxin, 21 ngày sau công cường độc vịt phải sống sót, còn vịt đối chứng chết với triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả vịt.Như vậy, qua kết quả nghiên cứu chúng tôi khẳng định hỗn dịch kháng nguyên dịch tả vịt nhược độc chế từ chủng DP-EG-2000 được bảo quản sau 5 năm ở dạng tươi ở -86⁰C có độ an toàn và hiệu lực cao.

4. KẾT LUẬN

Chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 sau thời gian bảo quản 5 năm ở -86⁰C dưới dạng nước trứng tươi vẫn có tính thích ứng cao và ổn định trên phôi gà 9 ngày tuổi. Virus nhân lên trong phôi, gây chết phôi với bệnh tích đặc trưng, số phôi chết tập trung ở khoảng thời gian từ 49-72 giờ.Chỉ số sinh học ELD₅₀ và EID₅₀ của chủng virus vaccine nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 ổn định sau những lần cấy chuyển trên phôi trứng gà, chỉ số ELD₅₀ và EID₅₀ tương ứng là 10^-4,2 và 10^-5,1/0,2 ml. Hỗn dịch virus an toàn và hiệu lực cao được thể hiện qua tỷlệ bảo hộ đạt từ 96-100%. Chủng virus dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 đáp ứng được yêu cầu trong công tác bảo tồn nguồn gen virus học thú y và trong sản xuất vacxin phòng bệnh dịch tả vịt cho vịt.

Tài liệu tham khảo

1. Lê Văn Lãnh (1991), “Khảo sát một số đặc tính sinh học giống virus vacxin Jansen và chế vacxin phòng bệnh dịch tả vịt”, Tuyển tập công trình nghiên cứu KHKT Nông nghiệp 1986-1991, NXB Nông nghiệp, tr. 120-121.

2. Li, Y., Huang, B., Ma, X., Wu, J., Li, F., Ai, W., … và Yang, H. (2009). Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus. Virology,391(2), 151-161.

3. Morrissy, C. J., Daniels, P. W., Lowther, S. L., Goff, W., Pritchard, I., và Tran, D. T. (2003). Duck plague in Vietnam and the development of diagnostic capability. Proceedings of a workshop held at NAVETCO, Ho Chi Minh City, Vietnam, 18-20 August 2003.

4. Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2013) Bệnh truyền nhiễm của động vật nuôi và biện pháp khống chế, NXB Nông nghiệp.

5. Nguyễn Bá Hiên, Lê Văn Phan, Đặng Hữu Anh, Lê Huỳnh Thanh Phương (2016), Một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus vaccine nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XXII, số 1, trang 39-49.

6. Nguyễn Đức Hiền (2012). Đáp ứng miễn dịch tạo thành sau tiêm chủng vacxin phòng bệnh dịch tả vịt ở vịt xiêm. Khoa học kỹ thuật Thú y, 18 (5), 1-5.

7. OIE (2000). Manual of Standards for diagnostic test and vaccines, http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00111.htm. 20/05/2014

8. OIE (2012), Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.07_DVE.pdf

9. OIE Terrestriral Manual (2010). Duck Virus Hepatitis. Chapter 2.3.8.

10. Wolf, K và Burke, C. N. (1982). Survival of duck plague virus in water from Lake Andes National Wildlife Refuge, South Dakota.Journal of wildlife diseases, 18 (4), 437-440.