Công nghệ phát hiện tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thủy sản

Sự cần thiết

Enrofloxacin là loại thuốc kháng sinh thuộc họ Fluroquinolone giúp kháng bệnh cho tôm cá, tuy nhiên chất này có thể gây hại cho sức khỏe người sử dụng sản phẩm (gây giảm thị lực cho mắt, gây viêm khớp…). Là một loại kháng sinh nằm trong danh mục cấm. Trên thực tế nhiều hộ nuôi trồng thủy sản vẫn lạm dụng thuốc này. Các nước nhập khẩu tôm của Việt Nam đang lên tiếng cảnh báo về tình hình nhiễm Enrofloxacin. Các mặt hàng thủy sản trong nước cũng có nguy cơ nhiễm Enrofloxacin.

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích. Bộ kit ELISA phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh Enrofloxacin có nhiều ưu điểm, đặc biệt là tất cả các quy trình từ đưa mẫu vào phân tích đến cho ra kết quả chỉ mất 30 phút, nhanh hơn rất nhiều so với các phương pháp khác.

Thực hiện nhanh, thao tác đơn giản, dễ thực hiện. Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. Không cần nhân viên chuyên môn cao. Độ nhạy cao, có khả năng phát hiện dư lượng Enrofloxacin ở ngưỡng phát hiện 1 ppb. Chi phí kiểm mẫu thấp do có thể kiểm đồng thời một số lượng mẫu lớn.

Ngoài ra, bộ kit này là có thể phân tích khoảng 50 – 80 mẫu cùng một lúc.

Thành phần của bộ kit bao gồm:

Đĩa giếng: Đĩa ELISA 96 giếng được sử dụng nhiều nhất thường là polystyrene hoặc các dẫn xuất của polystyrene thu được bằng cách biến đổi hóa học hoặc chiếu xạ bề mặt. Phổ biến nhất là đĩa 96 giếng được thiết kế thành 8 hàng và 12 cột. Mỗi giếng giữ khoảng 350 µl thể tích với một khu vực bên trong khoảng 2,5 cm².

Chứng âm, chứng dương: Có tác dụng kiểm tra xem mẫu, hóa chất và điều kiện chạy đã chuẩn chưa.

Cộng hợp, cơ chất, dung dịch hãm màu.

Quy trình

Nguyên lý: Kháng thể đặc hiệu kháng Enrofloxacin được gắn lên giếng. Cho mẫu vào, nếu Enrofloxacin có trong mẫu phân tích sẽ bị kháng thể bắt giữ, các tạp chất bị rửa trôi. Cho thêm cộng hợp giữa Enrofloxacin và enzyme vào giếng, khi đó nồng độ Enrofloxacin sẽ được hiển thị dựa trên mức độ phát quang của mỗi giếng. Nếu nồng độ Enrofloxacin cao tương ứng với màu nhạt, còn nồng độ Enrofloxacin thấp tương ứng với màu đậm. Vì vậy, chỉ cần nhìn vào 2 màu đậm hoặc nhạt là có thể biết được thủy sản có nhiễm Enrofloxacin hay không.

Xử lý mẫu: Thông thường có thể xử lý mẫu theo hai cách:

Đối với hệ số pha loãng 3 lần: Cho 2 g mẫu vào ống ly tâm, sau đó cho thêm 4 ml dung dịch methanol 70% vào. Lắc mẫu trong 20 phút. Tiếp đến, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy 2 ml dịch trong, thổi khô, sau đó hòa cặn lại bằng dung dịch methanol 35%. Độ pha loãng là 3 lần.

Đối với hệ số pha loãng 6 lần: Cho 2 g mẫu vào ống ly tâm, sau đó cho thêm 4 ml dung dịch methanol 70% vào. Lắc mẫu trong 20 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút. Rút 1 ml dịch trong pha loãng với 1 ml dung dịch pha loãng đi kèm.

Tiến hành phản ứng

Cho 50 µl dung dịch chuẩn Enrofloxacin và dung dịch mẫu vào mỗi giếng. Cho 50 µl cộng hợp enzyme vào các giếng đã cho chuẩn và mẫu. Ủ tại nhiệt độ phòng trong 30 phút. Rửa các giếng bằng dung dịch rửa 3 lần. Cho 100 µl cơ chất hiện màu vào tất cả các giếng, ủ trong 30 phút.

Kết quả

Để đọc mật độ quang bằng máy so màu thì cho vào mỗi giếng 50 µl dịch hãm màu, hỗn hợp sẽ chuyển sang màu vàng, sau đó đọc tại bước sóng 450 nm. Cách đọc như sau:

Đối chứng dương: Màu rõ ràng, độ hấp thụ ánh sáng (A) phải > 0,6

Đối chứng âm: Không màu hoặc màu nhạt, A phải <  0,1

Mẫu dương tính: Có màu rõ ràng, A phải > 0,3

Lưu ý: Toàn bộ thuốc thử phải bảo quản trong lạnh (4 – 8⁰C). Khi tiến hành thí nghiệm phải đưa toàn bộ thuốc thử về nhiệt độ phòng. Không để các thuốc thử tiếp xúc ánh nắng.

Nguyễn An